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益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響

來源:核心期刊咨詢網位置:醫學論文時間:2019-10-31 10:1112

  〔摘要〕 目的 研究益氣解毒方抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖的效應。方法 采用實時無標記細胞功能分析技術(real-time unlabeled cell function analysis technique, RTCA)動態監測不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的益氣解毒方水提物對人鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響;采用CCK-8法檢測不同濃度益氣解毒方水提物對人鼻咽癌CNE2細胞增殖能力的影響;通過高通量細胞成像多功能檢測系統Cytation5監測不同濃度益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖形態的影響;采用Western Blot技術檢測不同濃度益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA表達的影響。

動物醫學論文

  《動物學雜志》(雙月刊)創刊于1957年,是由中國科學院主管、中國動物學會和中國科學院動物研究所主辦的綜合性學術刊物。

  結果 RTCA 和 CCK-8 法實驗結果顯示,與空白對照組比較,益氣解毒方水提物可以明顯抑制鼻咽癌CNE2細胞的增殖,而且隨著益氣解毒方水提物的作用時間越長,其抑制效應越顯著(P<0.05);Cytation5結果顯示,與空白對照組比較,不同濃度益氣解毒方水提物處理CNE2細胞后,細胞形態發生了明顯變化,且濃度越高,作用時間越長,細胞膜皺縮,細胞核質濃縮、破碎更明顯;Western Blot結果顯示,與空白對照組比較,益氣解毒方水提物能明顯抑制CNE2細胞中增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(P<0.05)。結論 益氣解毒方水提物能明顯抑制鼻咽癌細胞增殖,該效應與其抑制增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達有關。

  〔關鍵詞〕 益氣解毒方;鼻咽癌;細胞增殖;Survivin;XIAP;PCNA

  鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是目前比較常見的頭頸部惡性腫瘤,在南方的發病幾率比較高[1],其發病與遺傳因素、EB病毒感染、環境影響等關系密切[2-3],目前公認鼻咽癌的有效治療方法為放療、化療,但放化療有其固有的局限性,如敏感性降低、放療后的不良反應大、復發甚至轉移等[4],尋求一種更加安全高效的診療方式是耳鼻咽喉科醫生在臨床治療中迫切需要解決的問題。

  益氣解毒方(以下簡稱YQ)是湖南中醫藥大學第一附屬醫院田道法教授依據臨床經驗創立的經驗方,能夠有效減輕放療化療所帶來的副反應[5]。前期體內外實驗研究表明,該方能夠有效抑制人鼻咽癌不同分化類型細胞株,如5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HNE1等細胞的增殖、遷移,并具有誘導其凋亡的效應[6-10]。

  本研究選取CNE2細胞株,從增殖、形態變化方面觀察益氣解毒方水提物對鼻咽癌CNE2細胞增殖效應的影響,通過實時無標記細胞功能分析技術(real-time unlabeled cell function analysis technique, RTCA)和CCK-8法檢測益氣解毒方水提物在不同時間點對CNE2細胞的抑制增殖效應,采用Cytation5動態監測益氣解毒方水提物對CNE2細胞形態變化的影響,最后用Western Blot檢測益氣解毒方水提物對CNE2細胞增殖相關蛋白Survivin、XIAP、PCNA表達的影響,探討益氣解毒方抑制CNE2細胞增殖的作用機制,現報道如下。

  1 材料與方法

  1.1 細胞株

  人鼻咽癌細胞株CNE2,購自北京北納創聯生物技術研究院,本實驗室傳代培養。

  1.2 實驗藥物及試劑

  益氣解毒方藥物組成及水提物的制備:黃芪30 g,黨參15 g,黃連10 g,白花蛇舌草10 g,茯苓15 g,天花粉10 g,甘草6 g。煎煮收集藥液濃縮,并冷凍干燥,干燥完全后將水提物-20 ℃密封保存,用培養基配成4.0 mg/mL的母液,主要參考廖雪等[11]的制備方法。RPMI-1640培養基、PBS緩沖液(Hyclone公司);胎牛血清(Gibco公司);DMSO(Amresco公司);CCK-8試劑盒(日本同仁公司);一抗Survivin、XIAP、PCNA(CellSignalingTechnology,CST公司)。

  1.3 實驗儀器

  賀利氏HERAcell 150i CO2培養箱(賽默飛世爾公司);ELX800全自動酶標分析儀(BioTek公司);5415R高速冷凍離心機(Eppendorf公司);實時無標記細胞功能分析儀(艾森生物科技公司);Cytation5高通量細胞成像多功能檢測系統(美國伯騰儀器有限公司);倒置顯微鏡(Olympus 公司);Odyssey CLX熒光掃描成像系統(Gene有限公司)。

  1.4 方法

  1.4.1 細胞培養 將鼻咽癌CNE2細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中,置于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫細胞培養箱內培養,細胞生長至70%~80%傳代,取對數生長期細胞用于實驗。

  1.4.2 RTCA監測細胞增殖情況 取對數生長期CNE2細胞,消化重懸成單個細胞,調整濃度為每毫升5×104個細胞,接種到RTCA專用細胞增殖檢測培養板,每個孔加入100 μL CNE2細胞懸液,等細胞指數(cell index, CI)達到1.0時,加入不同濃度0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL益氣解毒方水提物(前期實驗結果顯示,此濃度范圍藥物對細胞無毒性),同時設空白對照組(Control組),每個組3個復孔,不同濃度組每孔加入藥液200 μL,Control組每孔加入細胞培養液200 μL,采用RTCA動態監測,并用CI值表示CNE2細胞的增殖狀況。

  CI=(Rn-Rb)/15

  Rn表示某個孔接種了細胞后的電極阻抗值,Rb表示某個孔中只有培養基時的背景阻抗值[12]。根據曲線分析水提物的藥效隨濃度及時間變化的特征,并用儀器自帶的軟件計算出合適時間點的半數抑制率濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50) 。

  1.4.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期的CNE2細胞,按照每100 μL培養液中5×103個細胞種入96孔板,過夜,待CNE2細胞貼壁后,藥物組每個孔分別加入不同濃度的200 μL含藥培養液,Control組每孔加入細胞培養液200 μL,實驗分組同“1.4.2”,每個組設置5個復孔,培養箱中培養一定時間。另外,設定只加細胞培養液、不加CNE2細胞的空白孔(用于A值校正)。藥物作用24、48、72 h后,每個孔(包含空白孔)分別加100 μL現配的CCK-8溶液,繼續培養2 h,實驗重復3次。酶標儀檢測450 nm波長的吸光度值(A值),記錄實驗結果,計算出細胞的增殖率及各時間點的IC50值。

  細胞增殖率=(A值實驗組-A 值空白孔)/(A值Control組-A值空白孔)×100%

  1.4.4 高通量細胞成像多功能檢測系統Cytation5監測細胞形態變化 取對數生長期的CNE2細胞,消化重懸成單個細胞,96孔板鋪板,按照5×103個細胞每個孔,加100 μL體積細胞懸液到每個孔,過夜,待CNE2細胞貼壁后,根據“1.4.2”結果,確定水提物處理CNE2細胞的濃度,藥物組每個孔分別加入不同濃度水提物0.25、0.50、1.00 mg/mL的含藥培養液200 μL,Control組每孔加入細胞培養液200 μL,采用Cytation5監測細胞生長形態,并設定6 h拍攝一次細胞形態圖像,并記錄實驗結果。

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